Vad håller jag på med egentligen?

Jag sitter på jobbet och väntar på en reaktion som ska inkuberas i 36 grader under minst fem timmar, så jag tänkte att jag skulle ge en liten uppdatering. Helgen var finfin i Glasgow, men det blev ingen fest med folket från Dundee, Olle och jag gick på stan i lördags och var helt färdiga när vi kom hem, så vi degade bara framför våra skärmar och kollade fotboll. I söndags blev det hemmamys, det var inte jättefint väder så vi stannade inne och underhöll oss själva med bland annat fotboll återigen.

Vi började hurtigt i lördags med ett marknadsbesök.

Vi tog en sväng på stan.

Olle dreglade i Lego-fönstret...

Vi käkade mexikanskt på Pinto.

Efter stadsbesöket gick vi hem och hejade på Brasilien.

I söndags var vi som sagt bara hemma, men vi bakade lite, bland annat
bagels (för första gången!).

Jag bakade rulltårta för första gången också!

Olle hjälpte mig med kokos- och smörkrämen.

Jag åkte tillbaka till Dundee i söndags kväll, men kommer nog inte att göra om det. Det var läskigt att gå hem i mörkret... Dock var det skönt att komma till jobbet i hyfsad tid igår, så det jämnade ut sig. Jag hade inte jättemycket att göra, men det var spännande att se om mitt experiment äntligen funkat (vilket det hade, i alla fall mestadels). Jag sitter just nu och väntar på resten för att se om jag äntligen kan gå vidare i morgon. 

Eftersom jag har en dryg timme kvar av min väntan tänkte jag skriva ner, förhoppningsvis tillräckligt förenklat vad det är jag gör i labbet, så om intresse inte finns, ge upp här. Om inte, håll i hatten, det här kommer att bli långt!

Vårt labb jobbar med trypanosomer, tropiska encelliga parasiter som orsakar Afrikansk sömnsjuka. Dock jobbar vi inte med parasiter som smittar människor, utan endast formen Trypanosoma brucei brucei, som orsakar sjukdom i kor. Vårt labb är dessutom väldigt säkert och eftersom sjukdomen sprids genom bett från tse-tseflugor finns ingen större smittorisk om vi skulle råka ha en eller annan farlig parasit (så länge man inte sticker sig med något så klart!).

Mitt projekt är inom drogresistens, de mediciner som finns emot trypanosomer är giftiga och trypanosomerna lyckas hela tiden utveckla motståndskraft mot nya eller gamla läkemedel som används. Dundee DDU (Drug Discovery Unit) har nyligen fått pengar för att samarbeta med akademiska forskare och större farmakologi-företag för att forska fram nya potentiella mediciner mot tropiska sjukdomar som Afrikansk sömnsjuka, och i en av deras undersökningar har de tittat närmare på trypanosomernas gener och vilka som skulle kunna vara involverade i drogresistens och vilka som skulle kunna vara bra mål för nya terapier.

Från detta har jag fått två gener, som vi inte vet speciellt mycket om, E1 ubiquitin-aktiveringsenzym och myotubularin (troligen ett fosfatas-enzym). Vi vill studera vilken effekt det har på våra trypanosomer om vi inkapaciterar dessa gener. För att göra detta börjar man först med att amplifiera våra gener, genom att låta ett program designa ”primers” som är specifika för våra gener och som agerar som skyltar och visar var kopieringsenzymet Taq ska kopiera. Så, jag blandar mina primers med Taq, buffer, en genmall, lite MgCl2, vatten och byggblock kallade nukleotider som ordnas av Taq så att de motsvarar genmallen och kan agera som nya mallar. Detta sker i en PCR (Polymerase Chain Reaction) maskin som kör ett program som består av cykler av olika steg med olika temperaturer, och efter varje cykel får vi nya kopior av våra gener. Ett program tar ca 1.5 h, och efter det måste jag ladda lite av mina prover på en gel där mitt negativt laddade DNA migrerar efter en elektrisk ström mot en pluspol. Mindre fragment migrerar snabbare, så jag kan se om jag jämför med en fragment-stege med bestämda storlekar hur stort fragmentet på gelen är och om det stämmer överens med min gen, så att jag inte får fel produkt om det finns andra fragment i provet (PCR är en väldigt känslig teknik). Det här var nog inte den bästa förklaringen, men det är ganska knivigt att förklara lätt tycker jag, men om det hjälper är det den här tekniken de använder sig av på t.ex. CSI för att matcha bovens DNA till någon misstänkt (de kollar om valda fragment från deras DNA matchar). Dock går det lite snabbare för dem än i verkligheten! 

PCR-maskinen.

Så här ser min gel ut, väldigt fint laddad idag!

Man laddar proverna i små brunnar på gelen, därefter väver sig fragmenten
emellan porer i gelen och neråt med strömmen.

Efter att jag sett att jag fått rätt produkter tar jag resten av mitt prov och rengör genom att tillsätta PB-buffer och provet till en filteringskolumn, centrifugera i en minut, hälla bort avfallet, tvätta med PE-buffer, centrifugera, hälla bort avfallet, centrifugera ut resten av vätskan och eventuella salter (mycket viktigt - salter kan senare göra att proven exploderar när jag elchockar dem) och sedan tillsätta EB-buffer till filtret och centrifugera för att få ut produkten i en ny tub. 

Vår lilla centrifug.

Med min rena produkt sätter jag sedan upp en så kallad ”restriction digest”, det vill säga jag blandar mitt prov med buffer och två enzymer som agerar som små saxar och klipper ett visst mönster på ändarna av mina genfragment. Sedan klipper jag en vektor, en färdiggjord plasmid, med samma enzym så att jag kan klistra ihop dem. En plasmid är ett runt DNA-element som kan bära många olika gener och tas upp av olika bakterier och kopieras med dem, så att jag kan få massor av mina genfragment.

Klippandet måste ske vid 36°C grader då mina enzym funkar bäst då, och det är det här som tar 5 timmar (minst!). Efter klippandet laddar jag mina prover på en ny gel för att se om de verkligen blivit klippta. Om de har det tar jag en skalpell och skär ut mina fragment från gelen under UV-strålning och tar sedan de små bitarna av gel och rengör dem för att få bort gelen, genom att först blanda med QG-buffer, inkubera i 50°C grader i 10 min, addera isopropanol, ladda allt i en filtreringskolumn, centrifugera, hälla av, tvätta med QG igen, centrifugera, hälla av, upprepa med PE-buffer, och sedan tömma på all vätska och flytta över till en annan tub där jag med hjälp av EB-buffer löser ut min produkt från filtret. Låter det bekant än?

När allt är rent och fint blandar jag i mitt klister-enzym och förvarar kallt över natten. På morgonen måste jag sedan rengöra den här reaktionen, genom att tillsätta vatten, phenol chloroform (i ett rum med fläkt så att jag inte svimmar av ångorna), blanda och centrifugera för att få två separata lager, flytta översta lagret till en ny tub och slänga resten, addera en droppe glykogen och en massa iskall 100% etanol och förvara i frysen i en timme, centrifugera, hälla av etanol och tillsätta iskall 70% etanol, centrifugera, hälla bort, centrifugera och sedan blanda ut den resulterande DNA-klumpen i sterilt vatten. Här kan jag om jag vill ladda en del av mitt prov på en gel för att se om jag får ett eller två band, så att jag vet om de klistrats ihop eller inte, men resultaten är si och så, så jag använder de alltid i alla fall.

Det här får sedan stå och vila ett tag medan jag tinar kompetenta bakterieceller (kapabla att ta upp plasmid-DNA) från vår -80°C frys på is, kyler kuvetter och värmer agarplattor. När cellerna tinat blandar jag dem med min rena, förhoppningsvis ihopklistrade, plasmider i mina kuvetter och antingen värmechockar jag dem (om jag använder kemiskt kompetenta celler – då behöver jag inte heller rengöra dem, så jag kan skippa förra steget) i ett 42°C vattenbad för att sära på deras membran så att de kan ta upp mina plasmider, eller så elchockar jag dem. Efter det ska de tillbaka på is ett tag innan jag brer ut dem på min agarplatta. Agarplattor är plattor av medium där bakterierna kan växa, och våra plattor innehåller även ampicillin, så att bara bakterier som tagit upp min plasmid, som innehåller en resistensgen mot ampicillin, kan växa.

Så här långt har jag kommit alla gånger jag upprepat experimentet från start, men inte längre, för jag får sällan några kolonier på mina plattor dagen efter, det vill säga bakterierna kan inte växa då de inte tagit upp min plasmid. Men, förra veckan använde jag en ny plasmid-vektor och nya fräscha celler, så jag fick hyfsat med kolonier. Då går jag vidare med att plocka kolonier och odla fyra kolonier från varje platta i varsin tub med flytande medium och ampicillin över natten (i 37°C i en skakande inkuberingsmaskin), och dagen efter rengör jag sedan lite av detta för att få ut mina plasmider igen. Först centrifugerar jag tuberna för att få en klump DNA, sedan häller jag av vätskan och tillsätter kall P1- och P2-buffer för att spränga bakterierna, N3-buffer för att neutralisera reaktionen, centrifugera, ta vätskan och filtrera genom en kolumn för att få bort salt, kristaller och annat tjafs som inte ska vara med (med PB och PE-buffer som tidigare) och till sist löser jag ut mina plasmider i EB i en ny tub från filtreringsmembranet. Resulterande vätska kvantifierar jag sedan med en NanoDrop-maskin och ett datorprogram för att kolla om det finns ordentligt med DNA, och jag sätter även upp en ny klipp-reaktion med samma enzym som jag laddar på en gel för att se att jag verkligen har plasmider med rätt genfragment i. Om allt ser rätt ut fryser jag lite av min kultur så att jag aldrig behöver börja om och så odlar jag mer av de bästa klonerna (jag hade fyra, om ni kommer ihåg, fyra olika klonade kolonier från varje platta som jag odlat upp i medium).

Exempelkurva från NanoDrop.

Hit har jag kommit igår och idag, jag har äntligen lyckats klona in mina genfragment! Jag har ju skrivit tidigare att jag varit frustrerad över att ingenting funkar, och att jag har börjat om många gånger, men nu, efter detta plågsamma men informativa inlägg, kanske ni förstår mera hur många steg man måste gå igenom och på hur många ställen allt kan gå fel. Allt är dock värt det när man får resultat, och processen har varit väldigt lärorik!